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尚宝配资《食品安全导刊》刊号:CN11-5478/R 国际:ISSN1674-0270

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2,4-二硝基苯肼衍生化 ——高效液相色谱法测定面粉中的甲醛

2016-04-19 17:06:15 来源: 食品安全导刊

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  甲醛由于具有强烈的致癌和致畸性,中国食品安全法明确规定禁止在食品中加入甲醛。但是,由于甲醛具有防腐、漂白作用,一些不法分子为了利润依然违法添加,导致食品安全事件不断发生,因此,对食品中甲醛含量进行检测对于维护人民的健康有重要的意义[1]。由于甲醛紫外吸收非常的弱,通过衍生化反应引入有强紫外吸收的基团,这些衍生物可被液相紫外检测器检测。本文利用2,4-二硝基苯肼对甲醛衍生化,然后利用高效液相色谱测定面粉中甲醛的含量。

  材料与方法,市售面粉,甲醇,乙腈,2,4-二硝基苯肼均为分析纯(AR),购于天津市永大化学试剂有限公司;甲醛为标准品,购于环境保护部标准样品研究所。

  1.2 实验原理
 

  在酸催化的作用下,2,4-二硝基苯肼与甲醛反应生成红色的2,4-二硝基苯腙,然后在紫外的检测下,经过流动相的洗脱,在柱子上会有保留,从而间接测定甲醛的含量[2]。

  实验步骤 基本色谱条件

  色谱柱:Eclipase-XDB C18(4.6mm*250mm,5μm安捷伦科技有限公司)柱温箱温度:25℃;流动相:乙腈/水=60/40 (V/V);检测波长:350nm;流速=1ml/min;进样量为10μL。

  1.3.2 甲醛衍生化初始条件,取一定量的甲醛标准液或者样品溶液,加入2,4-二硝基苯肼(与甲醛的摩尔比为1:1),加入1ml 0.5mol/L的pH=5的醋酸钠-醋酸缓冲液,混匀50℃反应30min,取样采用HPLC进行分析。样品测定,精确称量市售面粉0.5g左右,精确到0.001g,然后加水稀释到50ml的容量瓶中,然后放置于超声波中超声30min,并精确取出 5ml,然后加入已经配好的1ml 2,4-二硝基苯肼溶液,1ml pH=5的醋酸钠-醋酸缓冲液,并加入甲醇定容到10ml的容量瓶中,摇匀,恒温60℃水浴中保持30 min,然后取出用5000r/min离心2min,经微孔滤膜过滤,滤液用于HPLC分析。

  结果与讨论

  衍生化初始pH的考察,2,4-二硝基苯肼与甲醛的亲核加成反应要在酸性条件下才能进行,酸度的大小会对反应能否进行到底有重要的影响。在pH介于2-5之间时,随着pH的升高,甲醛衍生的产物的峰面积增加,也就是pH的升高有助于甲醛衍生化产物的形成。当pH为6时,产物的峰面积反而降低。pH越低,解离出来的质子就越多,过多的质子会和2,4-二硝基苯肼上的氨基形成盐,会抑制反应的进行。当pH过高,解离出来的质子就越少,羰基就不容易被质子化,反应也不容易进行[3]。因此,选择pH=5作为衍生化最佳的pH。衍生化初始温度的考察,在反应体系初始pH=5的基础上,考察了不同温度对衍生化的影响。在30℃-60℃之间,随着温度的升高,峰面积也在增加,说明温度升高有利于产物的生成。但是当温度=70℃时,产物的峰面积反而下降,这可能是温度过高,甲醛挥发,反应液中甲醛的量偏低,而反应到产物峰面积的减少[3]。因此,确定最佳的温度为60℃。衍生化时间的考察,在初始pH=5,温度=60℃的基础上考察了衍生化时间对衍生化影响。在前30min,随着时间的延长,衍生化产物的峰面积一直在增加。当大于30 min后,产物的峰面积就不在增加,说明已经反应完全。选定30min为后续的衍生化时间。

  在确定甲醛衍生化的pH为5,温度为60℃,反应时间为30min的基础上,考察了不同的衍生化试剂(2,4-二硝基苯肼)与甲醛的摩尔比对产物峰面积的影响。当2,4-二硝基苯肼与甲醛的摩尔比值为1时,甲醛并没有反应完全,当2,4-二硝基苯肼的量增加到1.2倍时,产物的峰面积达到最大值。2,4-二硝基苯肼得量继续增加,产物的峰面积也不在增加。也就是说2,4-二硝基苯肼的用量为甲醛的1.2倍时为最佳。

表1 所采用方法的精确度
 

  从表1可以看出,在所称量的0.5g样品中平行5次实验中其平均值为3.35(mg/kg),RSD为4.41%,说明该方法的精确度非常的高。

  所采用方法的回收率

  向市售面粉中加入不同浓度的甲醛标准溶液,并采用上述衍生化并采用高效液相色谱的操作步骤进行。在原有市售面粉中甲醛含量为3.35 mg/kg的基础上依次加入3ml、6ml、9ml、12ml浓度为1.2μg/ml的甲醛溶液。

表2 方法的加标回收率
 

  从表2中可以看出,样品的回收率在97.1%-102.1%之间,说明样品的回收率也非常的高,也说明了该方法的可行性。

  2,4-二硝基苯肼衍生化甲醛的最佳条件pH=5,温度=60℃,时间为30min,2,4-二硝基苯肼的用量为甲醛的1.2倍时,该方法的RSD为4.41%,样品的回收率在97.1%-102.1%之间。方法的准确度和精确度都很具有很强的实际应用价值。

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